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Artículo publicado por Kimm Fesenmaier el 1 de febrero de 2016 en Caltech News

Traducción realizada por Dina Ródenas

Biólogos de Caltech han modificado un virus inofensivo de tal modo que puede entrar con éxito en el cerebro de un ratón adulto a través del torrente sanguíneo y llevar genes a las células del sistema nervioso. El virus puede ayudar a los investigadores a cartografiar los entresijos del cerebro, y promete ser de gran utilidad en el desarrollo de nuevas terapias para tratar patologías como el Alzheimer o la enfermedad de Huntington. Además, el enfoque de cribado que han desarrollado los investigadores para identificar el virus, podría usarse para diseñar nuevos vectores capaces de usar células diana en otros órganos.

“Al desarrollar un sistema que permite llevar genes atravesando la barrera hematoencefálica, seremos capaces de que éstos lleguen al cerebro de un adulto con un elevado grado de eficiencia”, dice Ben Deverman, investigador senior de Caltech, y autor principal de un artículo que describe este trabajo, publicado en línea el 1 de Febrero, en la revista Nature Biotechnology.

Barrera Hematoencefálica

Barrera hematoencefálica Crédito: Héctor Cordero

La barrera hematoencefálica permite al organismo mantener patógenos, y sustancias químicas potencialmente nocivas que circulan por la sangre, alejadas del encéfalo y la médula espinal. Este bloqueo semipermeable, compuesto por células muy próximas entre sí, desempeña un papel crucial en el mantenimiento y control de un entorno que permita al sistema nervioso central funcionar adecuadamente. Por ende, la barrera también hace prácticamente imposible que  muchos fármacos y otras moléculas lleguen al encéfalo a través del torrente sanguíneo.

Para “colar” genes a través de la barrera hematoencefálica, los investigadores de Caltech han usado una nueva variante de un pequeño e inocuo virus llamado “virus adeno-asociado” (AAV, por sus siglas en inglés). Durante las últimas dos décadas, los investigadores habían usado varios AAV como vehículos para transportar genes específicos al núcleo de las células; una vez allí, los genes podían ser traducidos o expresados a partir del ADN, en proteínas. En algunas aplicaciones, los AAV transportaban copias funcionales de genes para reemplazar a aquellos que tenían alguna mutación, presentes en individuos con enfermedades genéticas. En otras aplicaciones, se usaron para transportar genes que contenían instrucciones para generar moléculas como por ejemplo anticuerpos, o proteínas fluorescentes, que ayudan a los investigadores en el estudio, y realizar así un seguimiento de ciertas células.

Debido, en gran medida, al problema de la barrera hematoencefálica, los científicos han tenido un éxito limitado en el trasporte de AAV y su carga genética al sistema nervioso central. En general, se han centrado en el uso de inyecciones quirúrgicas, que llevan altas concentraciones del virus a un lugar concreto, pero muy poco a las áreas circundantes. Este tipo de inyecciones son, por cierto, muy invasivas. “Es necesario practicar un pequeño agujero en el cráneo y, a continuación, perforar el tejido con una aguja hasta llegar al lugar de la inyección”, explica Viviana Gradinaru, profesora adjunta de biología e ingeniería biológica en Caltech, y autora senior del artículo. “Cuanto más profunda es la inyección, mayor es el riesgo de hemorragia. Con una inyección sistémica, usando el torrente sanguíneo como medio de transporte, no se causaría ningún daño, y la distribución sería más uniforme”.

Además, apunta Gradinaru, “muchos trastornos no están debidamente localizados. Las patologías neurodegenerativas, como la enfermedad de Huntington, afectan a grandes áreas del encéfalo. Además, muchos comportamientos complejos tiene como mediadores a redes de interacción distribuidas. Nuestra capacidad para centrarnos en esas redes es clave, en términos de nuestros esfuerzos por comprender qué están haciendo esas vías, y cómo mejorarlas cuando no funcionan bien”.

En 2009, un grupo liderado por Brian Kaspar, de la Universidad Estatal de Ohi, publicó un artículo, que también fue incluido en Nature Biotechnology, en el que se mostraba que una cepa de un AAV llamada AAV9, inyectada en el torrente sanguíneo, podía llegar al cerebro, pero solamente era efectiva cuando se usaba en ratones neonatos, o muy jóvenes.

“El gran reto es cómo lograr ese mismo grado de efectividad en un adulto”, dice Gradinaru.

Pese a que nos gustaría diseñar un AAV que estuviera a la altura, el número de variables que rigen el comportamiento de un virus determinado, así como los entresijos del encéfalo, y su barrera, hacen de esta tarea un gran desafío. En lugar de hacer esto, los investigadores han desarrollado un análisis de selección de alto rendimiento, CREATE (Cre REcombinase-based AAV Targeted Evolution), que les permitió poner a prueba millones de virus in vivo simultáneamente para identificar aquellos que entraban mejor en el encéfalo y transportaban los genes a un tipo especial de células encefálicas conocidas como astrocitos.

Empezaron con el virus AAV9 y modificaron un fragmento de un gen que codifica un pequeño lazo en la superficie de la cápside  — la cobertura de proteínas que envuelve el material genético de un virus. Usar una técnica común de amplificación, conocida como reacción en cadena de la polimerasa (PCR), crearon millones de variantes del virus. Cada variante transportaba en su interior instrucciones genéticas para producir más cápsides como la suya.

Luego usaron su novedoso proceso de selección para determinar qué variantes transportaban de forma más efectiva los genes a los astrocitos del encéfalo. Es importante señalar que el nuevo proceso se apoya en un posicionado estratégico de la codificación de ges de las variantes de las cápsides en las hebras de ADN entre dos cortas secuencias de ADN, conocidas como posiciones lox. Estas posiciones son reconocidas por una enzima conocida como Cre recombinasa, que se une a ellas e invierte la secuencia genética entre las mismas. Inyectando los virus modificados en ratones transgénicos que sólo expresan la Cre recombinasa en astrocitos, los investigadores sabían que cualquier secuencia marcada por la inversión de posiciones lox había transferida con éxito su carga genética a la célula objetivo – los astrocitos.

Tras una semana, los investigadores aislaron ADN del tejido cerebral y la médula espinal, y amplificaron las secuencias marcadas, recuperando de este modo sólo las variantes que habían entrado en los astrocitos.

A continuación, tomaron esas secuencias, y las insertaron de nuevo en el genoma viral modificado, para crear una nueva biblioteca que pudiera ser inyectada en el mismo tipo de ratones transgénicos. Después de solamente dos ciclos de inyecciones, y amplificaciones, surgieron una buena cantidad de variantes de entre aquellos que fueron más efectivos en cruzar la barrera hematoencefálica, y entrar en los astrocitos.

“Hemos pasado de millones de virus, a solamente unos pocos con los que hacer pruebas, que son potencialmente útiles, y que podemos revisar sistemáticamente y ver cuáles surgen con propiedades deseables”, explica Gradinaru.

A través de este proceso de selección, los investigadores han identificado una variante denominada AAV-PHP.B como la más efectiva. Le han dado al virus este acrónimo en honor al fallecido biólogo de Caltech Paul H. Patterson debido a que Deverman inició su trabajo en el grupo de Patterson. “Paul tenía un compromiso por comprender los desórdenes cerebrales, y vio el valor en promover el desarrollo de herramientas”, explica Gradinaru, que también trabajó en el laboratorio de Patterson como estudiante no graduada.

Para poner a prueba el AAV-PHP.B, los investigadores lo usaron para transportar un gen que codifica una proteína con un brillo verde, lo que facilita la visualización de qué células la expresan. Inyectaron AAV-PHP.B o AAV9 (como control) en distintos ratones adultos y, tras tres semanas, usaron la fluorescencia verde para evaluar la eficacia con la que el virus entró en el encéfalo, la médula espinal, y la retina.

“Podíamos ver que AAV-PHP.B se expresó a través del sistema nervioso central de adultos con una alta eficiencia en la mayoría de tipos celulares”, comenta Gradinaru. Es más, en comparación con AAV9, AAV-PHP.B transporta los genes al encéfalo y la médula espina al menos 40 veces más eficazmente.

“Lo que proporciona la mayor parte del beneficio de AAV-PHP.B es su mayor capacidad de atravesar la vasculatura y llegar al encéfalo”, comenta Deverman. “Una vez allí, muchos AAVs, incluyendo al AAV9 son bastante buenos transportando genes a las neuronas y la glía”.

Gradinaru apunta que, puesto que AAV-PHP.B se distribuye a través del flujo sanguíneo, llega a otras partes del cuerpo. “Aunque en este estudio nos hemos centrado en el encéfalo, también podemos usar la técnica de aclarado de tejidos de todo el cuerpo para observar su biodistribución a lo largo del mismo”, apunta.

El aclarado de tejidos de todo el cuerpo mediante PARS CLARITY, un técnica desarrollada anteriormente en el laboratorio de Gradinaru para hacer que los tejidos de los mamíferos, normalmente opacos, fuesen transparentes, permite que los órganos sean examinados sin la laboriosa tarea de tomar finas secciones y colocarlas sobre portaobjetos. De este modo, el aclarado de tejidos permite a los investigadores seguir más rápidamente los vectores virales de aquellos que mejor se acoplan a las células y órganos de interés.

“En este caso, la prioridad era expresar los genes en el encéfalo, pero podemos ver mediante el uso del aclarado de todo el cuerpo que realmente puede darse expresión en muchos otros órganos, incluso en los nervios periféricos”, comenta Gradinaru. “Haciendo que los tejidos sean transparentes, podemos obtener más información sobre estos virus e identificar dianas que podríamos haber pasado por alto de otro modo”.

Los biólogos llevaron a cabo estudios de seguimiento durante un año tras las inyecciones iniciales, y hallaron que la proteína seguía expresándose de forma eficiente. Una expresión a tan largo plazo es importante para el estudio de terapias genéticas en humanos.

En colaboración con colegas de la Universidad de Stanford, Deverman y Gradinaru también han mostrado que AAV-PHP.B es mejor que AAV9 para llevar genes a las neuronas humanas y a la glía.

Los investigadores esperan empezar las pruebas de la capacidad de AAV-PHP.B para transportar genes terapéuticos en modelos de enfermedades. También están trabajando para evolucionar el virus y, de este modo, mejorar el rendimiento de las variantes que tienen como diana ciertos tipos de célula con más especificidad.

Deverman dice que el sistema CREATE podría aplicarse al desarrollo de AAVs capaces de transportar genes específicamente a muchos tipos distintos de células. “Hay cientos de líneas Cre transgénicas disponibles”, señala. “Los investigadores han puesto la Cre recombinasa bajo el control de elementos reguladores de genes de forma que sólo se fabrica en cierto tipo de células. Esto significa que, sin importar si tu objetivo son las células del hígado o un tipo concreto de neurona, casi siempre puedes encontrar un ratón que tenga la Cre recombinasa expresada en esas células”.

“El sistema CREATE nos dio un buen impulso inicial, pero estamos entusiasmados con el futuro potencial en el uso de este enfoque para generar virus que tengan una muy buena especificidad por tipo celular en distintos organismos, especialmente en los menos tratables genéticamente”, comenta Gradinaru. “Es sólo el primer paso. Podemos llevar todas estas herramientas e ideas hacia muchos caminos distintos para mejorar este trabajo, y nosotros — con el Instituto Beckman y sus colaboradores — estamos listos para seguir esas posibilidades”.

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